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【用途】用于雞傳染性支氣管炎病毒核酸(suan)的檢測。

【規格】50T/盒

【試劑】

【操作步驟】

1.核酸提取  

(1) 取疑似病料(liao)（氣管(guan)及分泌物(wu)、腎臟(zang)、肺(fei)臟(zang)等(deng)病毒(du)靶組(zu)織），用(yong)(yong)PBS研磨成1：3懸液(ye)，在(zai)-20℃凍融(rong)1次，經12000 r/min離心(xin)3 min，上清(qing)液(ye)-20 ℃保存備(bei)用(yong)(yong)。

（2）取200uL上清液，移入1.5mL滅菌EP管中，加入200uLSR-I，漩渦振蕩混合均勻，靜(jing)置5min。

（3）加75uL TU-1，漩渦振蕩混合均勻，12000r/min離心(xin)5 min。

（4）將上清轉移到新的2 ml離心管（試劑盒內提供）中，加入300 uL SR-Ⅳ，上下倒(dao)置6-8次，混(hun)合均勻。

（5）將步驟4中的混合液移入制備(bei)管中（試劑(ji)盒內提供），并將制備(bei)管置(zhi)于同一2 ml離心(xin)管，8000 r/min離心(xin)1min。

（6）棄濾液，將制備管置回到2 ml離心管中，加500 uL SR-II，室(shi)溫靜置(zhi)1min，12000 r/min離心1 min。

（7）棄濾液，將制備管置回到2 ml離心管中，加700 uL SR-Ⅲ，12000 r/min離心(xin)1 min。

（8）將制備管(guan)置回(hui)到2 ml離心管(guan)中，12000 r/min離心2min。

（9） 將制備管置于潔凈的1.5 ml離心管中（試劑盒內提供），在制備管膜中央加40 uL TU-2， 室溫靜置1 min。12000 r/min離心1 min洗脫。洗脫液即為模板，即用或(huo)-20℃凍存備用。

2.One-Step RT- PCR加(jia)樣體(ti)系(xi)(20uL體(ti)系(xi))

3.反應程序

4.電泳

配制1.0%瓊脂糖凝膠，取PCR產物5uL，混合1uL6xDNA Loading buffer，加樣于凝膠孔中，同時在相鄰孔加5uL DL2000 DNA Marker，在120-150v 電壓下，1×TAE液中(zhong)電泳15-20min，在紫(zi)外(wai)成像儀下觀(guan)察結果。

【結果判定】

在約490bp左右位(wei)置出現擴增帶，表明雞(ji)傳染(ran)性(xing)支(zhi)氣管炎病(bing)毒核酸檢測陽性(xing)；

若在490bp處沒有(you)條帶出(chu)現則樣品(pin)判(pan)為(wei)陰性。                            

                                        

                                  

【注意事項】

1. 陽(yang)性(xing)對(dui)照極易污(wu)染試驗環(huan)境，如果做(zuo)陽(yang)性(xing)對(dui)照,吸取(qu)陽(yang)性(xing)對(dui)照槍頭妥善處理

2. -20℃保存的試劑在使用前應完全融化，振蕩混勻后 8000rpm 離心 15 秒使(shi)液體全部(bu)沉于(yu)管底，置(zhi)冰盒(he)中(zhong)取用。嚴(yan)禁(jin)使(shi)用超過(guo)有效期(qi)限的試劑(ji)；嚴(yan)禁(jin)混用不同試劑(ji)盒(he)組分。

3. PCR 實(shi)驗(yan)室應(ying)按功(gong)能分(fen)為配(pei)液(ye)區(qu)(qu)、樣(yang)品處理區(qu)(qu)、擴(kuo)增區(qu)(qu)、電泳區(qu)(qu)。物流方向依次為配(pei)液(ye)區(qu)(qu) →樣(yang)品處理區(qu)(qu)→擴(kuo)增區(qu)(qu)→電泳區(qu)(qu)。所有(you)接觸病料的物品、器具，尤其是(shi)陽性對照(zhao)及PCR 產物和使用后(hou)的電泳緩(huan)沖液(ye)均應(ying)合理處置，以免污染實(shi)驗(yan)室。

4. 嚴格按(an)照國標(biao)和(he)說明書要(yao)求(qiu)操(cao)作(zuo)。吸(xi)取液(ye)體(ti)(ti)時移液(ye)器(qi)吸(xi)頭(tou)(tou)盡量在(zai)液(ye)體(ti)(ti)上層吸(xi)取，移液(ye)精(jing)確；吸(xi)取不同液(ye)體(ti)(ti)時必須更(geng)換移液(ye)器(qi)滴頭(tou)(tou)，防止試劑組分污染(ran)以及樣品污染(ran)。

5.試劑(ji)盒組分在(zai)生產分裝(zhuang)時(shi)考慮到液體(ti)的損耗，實際裝(zhuang)量略多于標注(zhu)裝(zhuang)量，因此嚴禁(jin)直接在(zai) 原包裝(zhuang)中(zhong)配制(zhi)反應(ying)體(ti)系，以免造成(cheng)反應(ying)體(ti)系各(ge)組分比例不準確。

【保存期】本(ben)制品有(you)效期為1年。

【聯系人】武經理        電話：

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