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通(tong)用名稱(cheng)：經典(dian)豬瘟液相阻(zu)斷ELISA抗體檢測試(shi)劑盒

【規格】96T×2塊

【用途】

檢測豬血清中的經(jing)典豬瘟抗體，適用于動物疫苗免疫抗體監測等(deng)。

【儲藏與有效期】2～8℃保存，有效期12個月。

【主要組份】 

【試驗操作】

1、洗滌液配制 

將濃縮(suo)洗滌(di)(di)液(20×)用(yong)蒸餾水或去(qu)離子水稀釋(shi)成洗滌(di)(di)液(1×)，即1份濃縮(suo)洗滌(di)(di)液加入19份蒸餾水，配(pei)制的洗滌(di)(di)液(1×)作為(wei)洗板用(yong)。

2、定性檢測方案(單孔定性，每板檢測92份血清樣本)

【操作步驟】

2.1加樣:設陰性對(dui)照血(xue)(xue)清(qing)(A1B1)和陽(yang)性血(xue)(xue)清(qing)(C1D1)各(ge)2孔(kong)，直接(jie)加(jia)入50ul/孔(kong)對(dui)照血(xue)(xue)清(qing)；其它(ta)為被(bei)檢樣品(pin)孔(kong)，預先在(zai)相應孔(kong)內加(jia)入45ul的(de)稀釋液，接(jie)著加(jia)入5ul/孔(kong)待檢血(xue)(xue)清(qing)；最后(hou)，在(zai)所有孔(kong)內均加(jia)入50ul的(de)HRP-單抗，被(bei)檢血(xue)(xue)清(qing)即為1：20稀釋。振蕩(dang)，混勻(yun)，37℃溫(wen)育30分鐘。

2.2TMB底物：用洗滌液洗板3遍，最后一次拍干，加入TMB底(di)物，50ul/孔，37℃溫育15分(fen)鐘。

2.3反應終止： 加入終止(zhi)液(ye)，50ul/孔，終止(zhi)反應。

2.4讀值：酶標(biao)儀450nm波長讀(du)數。

【計算方法】

2.5阻斷率計算

陰性對照平均值=（OD_-A1+OD_-B1）/2;

陽性對照平均值=（OD_+C1+OD_+D1）/2;

樣(yang)品阻斷率 PI=[（陰(yin)(yin)性對照平均值(zhi)-樣(yang)品OD值(zhi)）/陰(yin)(yin)性對照平均值(zhi)]×100%

根據以上(shang)公(gong)式計(ji)算被檢樣品(pin)和陽性(xing)對照(zhao)樣品(pin)的阻斷率。

   2.6試驗成立

    兩孔陰性對照OD450nm值至(zhi)(zhi)少(shao)一孔OD值大于0.5；兩孔陽(yang)性對照至(zhi)(zhi)少(shao)一孔的阻(zu)斷率大于60%。

【結果判定】

被檢樣品PI≥50%判(pan)為口蹄疫病毒O型抗體(ti)陽(yang)性；PI＜50%判(pan)為口蹄疫病毒O型抗體(ti)陰性。

3、定量檢測方案(每板檢測10或20份血清樣本)

在使(shi)用前，所有的試(shi)劑(ji)盒組(zu)份應恢復(fu)到室溫(wen)。試(shi)劑(ji)應輕輕旋轉或振蕩(dang)混勻。每個(ge)(ge)樣(yang)品使(shi)用一(yi)個(ge)(ge)單(dan)獨的吸頭(tou)。

3.1樣品稀釋: 取出(chu)抗(kang)原(yuan)包(bao)被板(ban)，根(gen)據不(bu)同(tong)的需要，選(xuan)擇(ze)圖(tu)1或圖(tu)2中的一種(zhong)布局進行操作。圖(tu)1為可檢(jian)測10份(fen)樣(yang)品布局圖(tu)；圖(tu)2為可檢(jian)測20份(fen)樣(yang)品布局圖(tu)。每(mei)次試驗(yan)，每(mei)板(ban)均需設置(zhi)陰陽(yang)性血清(qing)對(dui)照及4孔不(bu)加血清(qing)單(dan)抗(kang)對(dui)照。

以(yi)圖1為(wei)例操作，A1～A10每(mei)孔各加75µL的(de)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)液(ye)，其(qi)它所有孔內各加入50µL的(de)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)液(ye)。A1～A10每(mei)孔各加25µL的(de)待檢樣品，A11孔加50µL的(de)陽(yang)(yang)性(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)，A12孔加50µL的(de)陰(yin)(yin)性(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)，用(yong)排槍吹打混(hun)勻（每(mei)孔吹打3～5次），待檢樣品A1～A10分(fen)別以(yi)50µL/孔的(de)量從(cong)A到H連續2倍(bei)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)；陽(yang)(yang)性(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)A11以(yi)50µL/孔的(de)量從(cong)A到H連續2倍(bei)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)；陰(yin)(yin)性(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)A12以(yi)50µL/孔的(de)量從(cong)A到B連續2倍(bei)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)。待檢樣品在第1～10列從(cong)1:4稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)至(zhi)(zhi)1:512；陽(yang)(yang)性(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)，從(cong)1:2稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)至(zhi)(zhi)1:256，由于試劑(ji)盒(he)提(ti)供(gong)的(de)陽(yang)(yang)性(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)已1:4稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)，則變為(wei)從(cong)1:8稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)至(zhi)(zhi)1:1024；陰(yin)(yin)性(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)，從(cong)1:2稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)至(zhi)(zhi)1:4。

3.2 加入HRP－單抗：樣品稀釋好后(hou)，在所(suo)有孔(kong)內(nei)加(jia)入50ul的HRP－單(dan)抗，反應體(ti)系即(ji)為100µL/孔(kong)。加(jia)樣完(wan)畢后(hou)，所(suo)有稀釋度翻(fan)倍(bei)，待(dai)檢(jian)樣品從1:8～1:1024，陽性(xing)對(dui)照從1:16～1:2048，陰性(xing)對(dui)照從1:4～1:8，貼封板膜(mo)，振蕩混(hun)勻。將加(jia)好樣的ELISA反應板置于(yu)37℃溫(wen)育30分鐘(zhong)。

3.3洗板：用230μL（±20μL）洗(xi)(xi)(xi)滌(di)液(ye)(ye)(1×)洗(xi)(xi)(xi)滌(di)板孔，共洗(xi)(xi)(xi)滌(di)3次(ci)。每次(ci)洗(xi)(xi)(xi)滌(di)后應(ying)棄去孔內的液(ye)(ye)體。在最后一次(ci)洗(xi)(xi)(xi)滌(di)液(ye)(ye)棄去后，將孔中殘留的洗(xi)(xi)(xi)滌(di)液(ye)(ye)拍干。按(an)50μL/孔加入(ru)TMB底物，37℃避光溫育10～15min。

3.4讀值： 每孔再加50μL終止(zhi)液終止(zhi)反應(ying)，立即在(zai)450nm波長下讀取OD值(zhi)。

【結果分析】

3.5試驗成立判斷

不加(jia)血清(qing)單抗對(dui)照OD值應(ying)在2.0±1.5范圍內；

陽性對照抗體效價不低于1:1024±1滴(di)度；

陰性對照抗(kang)體(ti)效價應＜1:8。

3.6結果判定

不加(jia)血(xue)清(qing)單抗(kang)對照4孔(kong)(kong)，棄(qi)去最高和最低OD值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)，計算剩余2孔(kong)(kong)的(de)平均OD值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)，再除(chu)以2，即得50%對照值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)，該值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)即為(wei)臨界(jie)(jie)值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)，表示阻斷50％反應的(de)對照OD值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)。待(dai)檢樣品(pin)(pin)OD值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)＞臨界(jie)(jie)值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)，判為(wei)陰性(xing)孔(kong)(kong)；待(dai)檢樣品(pin)(pin)OD值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)≤臨界(jie)(jie)值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)，判為(wei)陽性(xing)孔(kong)(kong)。每(mei)份(fen)待(dai)檢樣品(pin)(pin)系(xi)列梯度稀釋中，陽性(xing)孔(kong)(kong)的(de)最高稀釋倍數即為(wei)該待(dai)檢樣品(pin)(pin)的(de)抗(kang)體效(xiao)(xiao)價。若臨界(jie)(jie)值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)處于(yu)兩個稀釋孔(kong)(kong)OD值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)之間(jian)，抗(kang)體效(xiao)(xiao)價取相鄰陽性(xing)孔(kong)(kong)和陰性(xing)孔(kong)(kong)稀釋倍數的(de)反對數中間(jian)值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)。如臨界(jie)(jie)值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)處于(yu)1:64（反對數值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)為(wei)1.8）與1:128（反對數值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)為(wei)2.1）之間(jian)，則判定該份(fen)待(dai)檢樣品(pin)(pin)的(de)抗(kang)體效(xiao)(xiao)價為(wei)1:90（反對數值(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)為(wei)1.95）。

抗體效價(jia)≥64，為疫(yi)苗(miao)免疫(yi)合格(ge)。

抗體效價計算對照表（反對數值）

4、注意事項

4.1 為使您(nin)的實驗獲(huo)得(de)正確結(jie)果，請您(nin)在實驗前仔(zi)細閱讀本說明(ming)書。

4.2 所有試劑使用前恢復(fu)至室(shi)溫(18～26℃)，以免溫度過低影響抗(kang)原抗(kang)體(ti)反應。

4.3實驗前應用溫(wen)(wen)度計檢(jian)查溫(wen)(wen)箱(xiang)溫(wen)(wen)度，溫(wen)(wen)度過(guo)高或過(guo)低影響OD值高低。

4.4 包(bao)被板反應時(shi)嚴禁堆疊放置，應該(gai)平(ping)鋪且(qie)板間有(you)空隙，不要離溫(wen)箱壁太近(jin)。

4.5實驗所用移液(ye)器及(ji)設備應(ying)定(ding)期(qi)校準。

4.6采集的(de)樣品要(yao)(yao)新鮮，并且最(zui)好不(bu)要(yao)(yao)溶血。血清標本(ben)在2～8℃放置(zhi)不(bu)要(yao)(yao)超過2天，室(shi)溫不(bu)超過8小時，如需長(chang)時間放置(zhi)應(ying)儲存(cun)于-20℃。