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通(tong)用名(ming)稱(cheng)：口蹄疫(yi)O型液(ye)相(xiang)阻斷ELISA抗(kang)體(ti)檢(jian)測(ce)試劑盒

英文名稱：Liquid-phase Blocking ELISA Kit for Detecting FMDV Type O Antibodies

【規格】96T×2塊(kuai)

【用途】

檢測牛、羊等血清中的(de)口蹄疫O型抗(kang)體，適用(yong)于動物疫苗(miao)免疫抗(kang)體監測。

【儲藏與有效期】2～8℃保存，有效期12個月。

【主要組份】 

【試驗操作】

1、洗滌液配制 

將濃縮洗(xi)滌液(ye)(ye)(20×)用(yong)蒸(zheng)餾(liu)(liu)水或去離子水稀(xi)釋成洗(xi)滌液(ye)(ye)(1×)，即1份濃縮洗(xi)滌液(ye)(ye)加(jia)入19份蒸(zheng)餾(liu)(liu)水，配制的洗(xi)滌液(ye)(ye)(1×)作為洗(xi)板(ban)用(yong)。

2、定性檢測方案(單孔定性，每板檢測92份血清樣本)

【操作步驟】

2.1加樣:設(she)陰性對照血(xue)清(qing)(A1B1)和陽性血(xue)清(qing)(C1D1)各(ge)2孔(kong)(kong)(kong)，直接(jie)加入(ru)50ul/孔(kong)(kong)(kong)對照血(xue)清(qing)；其(qi)它為被(bei)檢樣(yang)品孔(kong)(kong)(kong)，預先在相應孔(kong)(kong)(kong)內(nei)加入(ru)45ul的稀釋(shi)(shi)液(ye)，接(jie)著(zhu)加入(ru)5ul/孔(kong)(kong)(kong)待檢血(xue)清(qing)；最(zui)后(hou)，在所有孔(kong)(kong)(kong)內(nei)均(jun)加入(ru)50ul的HRP-O型(xing)FMD單抗，被(bei)檢血(xue)清(qing)即為1：20稀釋(shi)(shi)。振蕩，混(hun)勻，37℃溫育30分鐘。

2.2TMB底物：用洗(xi)滌液洗(xi)板3遍(bian)，最后一(yi)次(ci)拍干(gan)，加入(ru)TMB底物，50ul/孔(kong)，37℃溫育(yu)15分(fen)鐘。

2.3反應終止： 加入(ru)終(zhong)止(zhi)液，50ul/孔，終(zhong)止(zhi)反(fan)應。

2.4讀值：酶標儀450nm波(bo)長讀數。

【計算方法】

2.5阻斷率計算

陰性對照平均值=（OD_-A1+OD_-B1）/2;

陽性對照平均值=（OD_+C1+OD_+D1）/2;

樣(yang)品阻斷率 PI=[（陰性對照(zhao)平均(jun)值(zhi)-樣(yang)品OD值(zhi)）/陰性對照(zhao)平均(jun)值(zhi)]×100%

根據(ju)以上公式計算被檢(jian)樣品和陽性(xing)對(dui)照樣品的阻斷率。

   2.6試驗成立

    兩(liang)孔(kong)(kong)陰(yin)性對(dui)照OD450nm值至少(shao)一孔(kong)(kong)OD值大(da)于0.5；兩(liang)孔(kong)(kong)陽性對(dui)照至少(shao)一孔(kong)(kong)的阻(zu)斷率大(da)于60%。

【結果判定】

被檢樣品PI≥50%判為口蹄疫病毒O型抗體陽性；PI＜50%判為口蹄疫病毒O型抗體陰性。

3、定量檢測方案(每板檢測10或20份血清樣本)

在使(shi)用前(qian)，所有的試(shi)劑(ji)(ji)盒(he)組份應恢復(fu)到室溫。試(shi)劑(ji)(ji)應輕輕旋轉(zhuan)或振蕩混勻。每(mei)個樣品使(shi)用一個單獨的吸(xi)頭(tou)。

3.1樣品稀釋: 取出FMD－O抗(kang)原包被板，根據(ju)不同的需要(yao)，選(xuan)擇圖(tu)1或圖(tu)2中的一種布局(ju)進(jin)行操作。圖(tu)1為可檢(jian)測(ce)10份樣品布局(ju)圖(tu)；圖(tu)2為可檢(jian)測(ce)20份樣品布局(ju)圖(tu)。每次試驗，每板均需設置陰陽性血(xue)清對照及4孔不加血(xue)清單抗(kang)對照。

以(yi)(yi)圖(tu)1為例操作，A1～A10每(mei)孔(kong)(kong)各(ge)加(jia)75µL的稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)液，其(qi)它所有孔(kong)(kong)內各(ge)加(jia)入50µL的稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)液。A1～A10每(mei)孔(kong)(kong)各(ge)加(jia)25µL的待(dai)檢(jian)(jian)樣品(pin)，A11孔(kong)(kong)加(jia)50µL的陽性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)，A12孔(kong)(kong)加(jia)50µL的陰(yin)性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)，用排槍吹打混勻（每(mei)孔(kong)(kong)吹打3～5次），待(dai)檢(jian)(jian)樣品(pin)A1～A10分別(bie)以(yi)(yi)50µL/孔(kong)(kong)的量(liang)從A到(dao)H連續2倍(bei)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)；陽性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)A11以(yi)(yi)50µL/孔(kong)(kong)的量(liang)從A到(dao)H連續2倍(bei)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)；陰(yin)性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)A12以(yi)(yi)50µL/孔(kong)(kong)的量(liang)從A到(dao)B連續2倍(bei)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)。待(dai)檢(jian)(jian)樣品(pin)在第1～10列從1:4稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)至(zhi)(zhi)1:512；陽性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)，從1:2稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)至(zhi)(zhi)1:256，由于試劑盒提供的陽性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)已1:4稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)，則變為從1:8稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)至(zhi)(zhi)1:1024；陰(yin)性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)，從1:2稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)至(zhi)(zhi)1:4。

3.2 加入HRP－O型FMD單抗：樣品(pin)稀釋(shi)好后(hou)(hou)，在所(suo)(suo)有孔(kong)內加入50ul的HRP－O型(xing)FMD單抗，反應體(ti)系即為100µL/孔(kong)。加樣完畢后(hou)(hou)，所(suo)(suo)有稀釋(shi)度翻倍，待檢樣品(pin)從(cong)1:8～1:1024，陽性對照從(cong)1:16～1:2048，陰性對照從(cong)1:4～1:8，貼封板(ban)膜，振蕩(dang)混勻。將加好樣的ELISA反應板(ban)置于37℃溫育30分鐘。

3.3洗板：用230μL（±20μL）洗滌液(ye)(1×)洗滌板孔(kong)(kong)(kong)，共洗滌3次(ci)。每次(ci)洗滌后(hou)應棄去(qu)孔(kong)(kong)(kong)內的(de)(de)液(ye)體(ti)。在(zai)最后(hou)一次(ci)洗滌液(ye)棄去(qu)后(hou)，將孔(kong)(kong)(kong)中殘留(liu)的(de)(de)洗滌液(ye)拍干。按50μL/孔(kong)(kong)(kong)加入TMB底(di)物，37℃避光(guang)溫育10～15min。

3.4讀值： 每孔再加(jia)50μL終(zhong)止液終(zhong)止反應，立即在450nm波(bo)長(chang)下(xia)讀(du)取OD值。

【結果分析】

3.5試驗成立判斷

不加血清單抗對照OD值應(ying)在2.0±1.5范圍(wei)內(nei)；

陽性對照抗(kang)體效價不低于1:1024±1滴度；

陰性對照(zhao)抗體(ti)效價(jia)應＜1:8。

3.6結果判定

不加血(xue)清單抗對(dui)(dui)照(zhao)4孔(kong)(kong)，棄去(qu)最高(gao)(gao)和最低OD值(zhi)(zhi)(zhi)，計算剩余2孔(kong)(kong)的平均(jun)OD值(zhi)(zhi)(zhi)，再除以2，即得50%對(dui)(dui)照(zhao)值(zhi)(zhi)(zhi)，該(gai)值(zhi)(zhi)(zhi)即為臨(lin)界(jie)(jie)值(zhi)(zhi)(zhi)，表(biao)示阻斷50％反(fan)(fan)應的對(dui)(dui)照(zhao)OD值(zhi)(zhi)(zhi)。待檢樣(yang)品(pin)(pin)OD值(zhi)(zhi)(zhi)＞臨(lin)界(jie)(jie)值(zhi)(zhi)(zhi)，判為陰性孔(kong)(kong)；待檢樣(yang)品(pin)(pin)OD值(zhi)(zhi)(zhi)≤臨(lin)界(jie)(jie)值(zhi)(zhi)(zhi)，判為陽性孔(kong)(kong)。每份待檢樣(yang)品(pin)(pin)系(xi)列梯度稀釋中(zhong)，陽性孔(kong)(kong)的最高(gao)(gao)稀釋倍數(shu)即為該(gai)待檢樣(yang)品(pin)(pin)的抗體效價(jia)(jia)。若臨(lin)界(jie)(jie)值(zhi)(zhi)(zhi)處(chu)(chu)于兩個稀釋孔(kong)(kong)OD值(zhi)(zhi)(zhi)之間，抗體效價(jia)(jia)取(qu)相鄰陽性孔(kong)(kong)和陰性孔(kong)(kong)稀釋倍數(shu)的反(fan)(fan)對(dui)(dui)數(shu)中(zhong)間值(zhi)(zhi)(zhi)。如臨(lin)界(jie)(jie)值(zhi)(zhi)(zhi)處(chu)(chu)于1:64（反(fan)(fan)對(dui)(dui)數(shu)值(zhi)(zhi)(zhi)為1.8）與1:128（反(fan)(fan)對(dui)(dui)數(shu)值(zhi)(zhi)(zhi)為2.1）之間，則判定該(gai)份待檢樣(yang)品(pin)(pin)的抗體效價(jia)(jia)為1:90（反(fan)(fan)對(dui)(dui)數(shu)值(zhi)(zhi)(zhi)為1.95）。

抗體效價≥64，為疫(yi)苗免疫(yi)合格。

抗體效價計算對照表（反對數值）

4、注意事項

4.1 為(wei)使您(nin)的(de)實驗獲得正確結果(guo)，請(qing)您(nin)在實驗前仔(zi)細閱讀本說明書。

4.2 所有試(shi)劑使用(yong)前(qian)恢復(fu)至室(shi)溫(18～26℃)，以(yi)免(mian)溫度過(guo)低影響抗原抗體反應。

4.3實驗前應用溫度(du)計(ji)檢查(cha)溫箱溫度(du)，溫度(du)過(guo)高(gao)或過(guo)低(di)影響OD值高(gao)低(di)。

4.4 包被板(ban)反應(ying)時嚴禁堆疊放(fang)置(zhi)，應(ying)該平(ping)鋪且板(ban)間(jian)有(you)空隙，不要(yao)離溫箱壁太近。

4.5實驗所用移液器(qi)及設(she)備應定(ding)期(qi)校(xiao)準。

4.6采集(ji)的樣品要(yao)新鮮，并且最好不要(yao)溶血(xue)。血(xue)清標本在2～8℃放置不要(yao)超過2天，室溫不超過8小時(shi)，如需長(chang)時(shi)間放置應儲存(cun)于(yu)-20℃。