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【試劑】

【操作步驟】

1.樣本前處理及核酸(suan)提(ti)取  

樣本前處理：

取適(shi)量皮膚丘疹、肺部病變組織(zhi)、淋巴結(jie)，于滅菌(jun)研(yan)缽充分研(yan)磨(mo)，用PBS按(an)照1：3體積稀釋成均勻乳劑，經(jing)10 000rpm離(li)心3 min。

核酸提取：

(1)取200μL上述樣本離心后(hou)上清液和10μL蛋(dan)白酶(mei)K加入一(yi)只新的(de)1.5mL離心管,然后(hou)加入200μL裂解液，劇烈(lie)振蕩。(蛋(dan)白酶(mei)K開蓋使用(yong)后(hou)建議(yi)存于2-8℃)混(hun)勻5～10秒。

(2)56℃溫浴(yu)10分(fen)鐘(zhong)。

(3)在上述離心管中加入200μL無水(shui)乙醇(chun)，充分(fen)振蕩(dang)混(hun)勻(yun)5～10秒。

(4)將步驟3中(zhong)混勻的(de)液體(ti)(ti)轉移至一只套有收(shou)集管(guan)的(de)純化柱(zhu)上(shang)，10 000rpm離心1分鐘，棄(qi)去套管(guan)內液體(ti)(ti)。

(5)將(jiang)500μL去蛋白漂洗(xi)液加入純化柱上，10 000rpm離心1分鐘，并棄去套管內(nei)液體。

(6)將700μL洗滌液加入純化柱上，10 000rpm離心1分鐘，并棄去套管內液體。

(7)可選：重復步驟(zou)（6）。

(8)再將純化柱放回接(jie)液管上(shang)，13 000rpm離心1分鐘。

(9)將純化柱移到一只干(gan)凈的(de)1.5mL離心管中。

(10)向(xiang)離(li)(li)心柱內加50μL洗脫(tuo)液(ye)，室(shi)溫靜置1分鐘后12 000rpm離(li)(li)心1分鐘，棄純(chun)化柱，離(li)(li)心管內液(ye)體中(zhong)含有基因組(zu)DNA。提純(chun)的基因組(zu)DNA如(ru)果(guo)不(bu)立即使用，請保存于(yu)-20℃。

2. 熒光PCR加樣體系（總體系20 μL）：將下列試劑加入PCR反應管中。

（注：陰、陽性對照設立，由試劑盒提供的陽性對照、滅菌水直接替換“模板”即可。）

3. 反應程(cheng)序

在(zai)熒光PCR儀上進行以下反應：95 ℃ 180s，循環95 ℃ 5 s，55℃ 10 s，72℃ 20 s，共45次, 每次循環的第三步（72℃ 20 s）收集熒光信(xin)號（報告(gao)基團(tuan)“HEX”，淬滅基團(tuan)“BHQ1”）。

【結果判定】

1 閾值設定

檢測結束后，根據(ju)收集的(de)熒光(guang)曲線和 Ct值(zhi)直接讀取檢測結果，Ct值(zhi)為(wei)每個反應管內的(de)熒光(guang)信號達到設(she)定的(de)閾值(zhi)時所經歷的(de)循環數。閾值(zhi)設(she)定原則根據(ju)儀(yi)器噪聲情況進行調整，以閾值(zhi)線剛好超過正(zheng)常陰性樣品(pin)擴增曲線的(de)最高(gao)點為(wei)準(zhun)。 

2 質控標準

(1) 陰(yin)性(xing)對照：無Ct值無擴增曲線。

(2) 陽性對照：Ct值≤30.0，并(bing)出現典型(xing)的擴增曲線(xian)。若陰、陽性對照組結果(guo)不成(cheng)立(li)，則視為無效檢(jian)驗(yan)。

3 結果描述及判定

陰性  被(bei)檢樣(yang)品(pin)無(wu)Ct值且無(wu)明(ming)顯擴增曲線，判為(wei)山羊痘(dou)病毒核酸陰性；

陽(yang)性  檢測樣品Ct值≤42.0且(qie)出現典型(xing)的擴(kuo)增(zeng)曲線時，判為山羊痘(dou)病毒(du)核酸陽(yang)性；

可疑  對(dui)于(yu)Ct值(zhi)＞42.0的(de)樣品且出現(xian)典(dian)型(xing)(xing)的(de)擴增(zeng)(zeng)曲(qu)線或者Ct值(zhi)≤42.0但無典(dian)型(xing)(xing)的(de)擴增(zeng)(zeng)曲(qu)線時(shi)，應重(zhong)檢，重(zhong)檢Ct值(zhi)≤42.0且出現(xian)典(dian)型(xing)(xing)的(de)擴增(zeng)(zeng)曲(qu)線時(shi)判為(wei)陽性，其他情況(kuang)均判為(wei)陰性。

【注意事項】

1.B盒使(shi)用(yong)之前請(qing)完全(quan)溶解并離心數秒后使(shi)用(yong)，蛋白酶(mei)K開蓋使(shi)用(yong)后建(jian)議保存(cun)于2-8℃。

2 反(fan)(fan)復凍融試劑將降低(di)檢測靈敏度，盡量減少反(fan)(fan)復凍融。

3 為避(bi)免樣本間的交叉(cha)污染(ran)，模板(ban)最后(hou)加(jia)(jia)(jia)，加(jia)(jia)(jia)模板(ban)時先加(jia)(jia)(jia)陰性對照，再(zai)加(jia)(jia)(jia)檢測樣品，最后(hou)加(jia)(jia)(jia)陽性對照，有(you)條件的實驗室加(jia)(jia)(jia)模板(ban)的移液(ye)器應與加(jia)(jia)(jia)其(qi)它組(zu)份的移液(ye)器分開。

4 上機前(qian)注意(yi)檢查確保反(fan)應混合液內無氣泡(pao)，且反(fan)應管(guan)蓋緊，以免熒(ying)光物質泄漏區污(wu)染(ran)儀器。

【生產企業】   

企業(ye)名(ming)稱：山東綠都生物科技(ji)有限公司

生產地址：山東省濱州市經濟開(kai)發區(qu)黃河二路169號(hao)綠都生物工程高科(ke)技園

電    話：       

【有效期】本制品有效期為1年(nian)，生產日期見(jian)包裝(zhuang)內側。