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【試劑】

【操作步驟】

1.樣本前處(chu)理(li)及核酸提取  

樣本前處理：

取適量病料(liao)心、肝、腸等組織，于滅菌(jun)研缽充分研磨，用PBS按(an)照1：3體(ti)積稀(xi)釋成均(jun)勻(yun)乳劑(ji)，經10 000rpm離心3 min。

核酸提取：

(1)取200μL上述樣(yang)本(ben)離心(xin)后(hou)上清(qing)液和10μL蛋(dan)(dan)白酶(mei)K加(jia)入(ru)一只新的1.5mL離心(xin)管,然(ran)后(hou)加(jia)入(ru)200μL裂解(jie)液，劇烈振蕩(dang)。(蛋(dan)(dan)白酶(mei)K開蓋使用后(hou)建議(yi)存于2-8℃)混勻5～10秒。

(2)56℃溫浴10分鐘。

(3)在上(shang)述離心(xin)管中(zhong)加入200μL無水乙醇，充分振蕩混勻(yun)5～10秒。

(4)將(jiang)步驟3中混勻的液(ye)體(ti)轉移至一只套有(you)收(shou)集管的純化柱上，10 000rpm離心1分(fen)鐘，棄去套管內液(ye)體(ti)。

(5)將500μL去(qu)蛋白(bai)漂洗液加入純化柱上，10 000rpm離心1分(fen)鐘，并(bing)棄去(qu)套管內液體。

(6)將700μL洗(xi)滌液加入純(chun)化柱上，10 000rpm離心1分鐘，并棄去套(tao)管內液體。

(7)可選：重復步驟（6）。

(8)再(zai)將純化柱放回接液管上，13 000rpm離心1分(fen)鐘(zhong)。

(9)將純化柱移到一只干凈的1.5mL離心(xin)管中。

(10)向離(li)(li)心(xin)柱內(nei)加50μL洗脫液(ye)，室溫靜(jing)置1分(fen)鐘后12 000rpm離(li)(li)心(xin)1分(fen)鐘，棄(qi)純化柱，離(li)(li)心(xin)管內(nei)液(ye)體中含有基因(yin)組(zu)DNA。提純的基因(yin)組(zu)DNA如果不(bu)立即使用，請保(bao)存(cun)于-20℃。

2. PCR加樣體系（總體系20 μL）：將下列試劑加入(ru)PCR反應管中。

（注：陰、陽性對照設立，由試劑盒提供的標準品直接替換“模板”即可。）

3. 反應程序

4. 電 泳

配制1%瓊(qiong)脂糖凝膠，取(qu)PCR產物(wu)5uL，加樣于凝膠孔中，同(tong)時(shi)在相鄰(lin)孔加3μl DL2000 DNA Marker，在120v-130v 電壓下(xia)，1×TAE液中電泳15-20min，在紫外成(cheng)像儀下(xia)觀察結果。

【結果判定】

    在(zai)372b左右位置出(chu)現擴增帶，核酸(suan)檢測(ce)為陽(yang)性（如圖(tu)）。

    在372b左右位置未出(chu)現擴增(zeng)帶，核酸(suan)檢測(ce)為陰(yin)性(xing) 。                         

                             ;      

                               

【注意事項】

1.B盒(he)使用之前請完全溶解并離心數秒后使用，蛋白酶K開蓋使用后建議保存于(yu)2-8℃。

2 反復凍融試劑將降低檢測靈敏度，盡量減少反復凍融。

3 為避免樣(yang)(yang)本間的交叉(cha)污染，模板(ban)最(zui)后(hou)加(jia)，加(jia)模板(ban)時先加(jia)陰性對(dui)(dui)照，再加(jia)檢測樣(yang)(yang)品(pin)，最(zui)后(hou)加(jia)陽性對(dui)(dui)照，有條件的實驗室加(jia)模板(ban)的移液器應(ying)與(yu)加(jia)其它組份的移液器分開。

4 上(shang)機前注意(yi)檢(jian)查確保反應(ying)混合(he)液內無氣泡，且反應(ying)管(guan)蓋緊。

【生產企業】   

企業名(ming)稱：山東綠都(dou)生物(wu)科技有限公司

生產地址：山東省濱州市(shi)經濟開發(fa)區黃河二路169號綠都生物工程高(gao)科技園

電    話：

【有效期】本制品有效期(qi)為1年，生產日期(qi)見包裝內側。